Artículos porcino

Actualización en el diagnóstico laboratorial de Pasteurella multocida y Streptococcus suis

Dos importantes patógenos que participan en el desarrollo del síndrome respiratorio porcino

Jueves 25 de febrero de 2016

La interpretación correcta de los resultados en el diagnóstico de la enfermedad respiratoria en el ganado porcino depende de los conocimientos que se tengan sobre epidemiología y de los detalles que se conozcan de la situación concreta de la explotación afectada.



Ivette Espinosa Castaño
Laboratorio de Bacteriología Animal
Dirección de Salud Animal del Centro Nacional de Sanidad Agropecuaria
espinosa@censa.edu.cu

Pasteurella multocida y Streptococcus suis son importantes patógenos que participan en el complejo respiratorio porcino (CRP), denominación dada a los cambios y lesiones que producen una disminución en la actividad respiratoria de los animales afectados. Se denomina complejo porque es una manifestación de etiología multifactorial con interacciones microbianas (Van der Sluijs y col., 2010). Los efectos del CRP son notables debido a la disminución en la conversión alimentaria y en los costes en medicación (Pijoan y col., 1999; Higgins y col., 2005).

P. multocida causa un amplio rango de presentaciones en varios hospedadores, y en el cerdo puede dar lugar a dos condiciones clínicas: la rinitis atrófica progresiva (RAP) y la pasteurelosis neumónica. S. suis también produce lesiones en el tracto respiratorio, pero las cepas muy virulentas dan lugar a meningitis y endocarditis. Además, S. suis puede infectar al personal con riesgo ocupacional y producir cuadros clínicos similares. En países de Asia existe un riesgo mayor debido a la crianza traspatio y al consumo de sangre derivada de los animales portadores (Vu Thi Lan Huong y col., 2014; Goyette-Desjardins y col., 2014; Bonifait y col., 2014).

En cualquier lugar del mundo en el que se explota intensivamente el porcino se produce, en mayor o menor grado, la enfermedad respiratoria, aunque existen variaciones regionales en relación con la presencia de patógenos respiratorios específicos, condiciones climáticas y tipos de alojamiento. El diagnóstico es uno de los aspectos prioritarios y se apoya en diferentes ensayos organizados en un algoritmo según las capacidades de los laboratorios. La correcta interpretación de los resultados depende de conocimientos sobre epidemiología y detalles sobre la situación concreta de la explotación afectada.

En la actualidad, existen diferentes métodos de laboratorio que permiten detectar con rapidez y especificidad el microorganismo patógeno a partir de cultivos o de muestras directas, y a su vez permiten abordar la diversidad bacteriana. El propósito de esta revisión es la actualización de las tendencias que rigen el diagnóstico y la tipificación de P. multocida y S. suis, dos bacterias de gran interés en el CRP.

Identificación y tipificación de P. multocida y S. suis

Cada una de estas dos especies comprende diferentes serogrupos y dentro de estos existe una población con cepas que presentan notables diferencias en cuanto a la virulencia (Subaaharan y col., 2010; Feng y col., 2014). Ambas bacterias pueden aislarse de animales asintomáticos (Bethe y col., 2009; Su y col., 2008). Por ello, son precisas herramientas de detección con un alto poder discriminatorio y se utilizan tres tipos de aproximaciones experimentales: los métodos microbiológicos, los ensayos moleculares y las pruebas inmunológicas (Rimler y col., 1989; Boot y col., 2004).

La presencia de colonias lisas, brillantes, de aspecto grisáceo y traslúcido, de aproximadamente 1 mm de diámetro, después de 24 horas en agar Columbia suplementado con sangre de carnero son típicas del género Pasteurella, la ausencia de crecimiento en agar Mac Conkey y la prueba oxidasa positiva permiten discriminar de otros géneros con características culturales similares. Mediante las pruebas bioquímicas es posible corroborar que se trata de P. multocida (Bethe y col., 2004; Boot y col., 2004; Dziva y col., 2008 ).

El género Streptococcus se identifica fácilmente a partir de sus características culturales, colonias pequeñas, la tinción de Gram revela células cocoides en pareja o en cadenas corta y la prueba de la catalasa es negativa. A continuación es preciso conocer de qué especie del género se trata, para lo cual es posible realizar pruebas bioquímicas. Aunque en ocasiones la identificación bioquímica es muy difícil debido a la presencia de otras especies de Streptococcus que son parte de la microbiota normal y son fenotípicamente similares a S. suis (Berthelot-hérault y col., 2000).

Los ensayos moleculares basados en la PCR son una alternativa para confirmar con rapidez y especificidad de qué especie se trata. Estos ensayos se utilizan en dos vías para la detección y para el análisis orientados a la tipificación (Barenfanger y col., 1999; Kerremans y col., 2008; Järvinen y col., 2009; Cai y col., 2014). Resulta factible realizar esta prueba a partir de la propia colonia del cultivo, de la siembra primaria de apenas 24 horas de incubación o, más rápido, a partir de un exudado tomado directamente de la muestra, sin cultivar.

Las dianas en el genoma bacteriano seleccionadas para la amplificación por PCR deben conservarse para confirmar de qué especie se trata, lo que garantiza su presencia en todas las cepas a encontrar. La selección de la diana es muy controvertida para S. suis. Okavvwuma y col. (2003) describieron una pareja de cebadores: la enzima glutamato deshidrogenasa (GDH). Marois y col. (2007) reportaron otros cebadores para un fragmento del ácido ribonucleico ribosómico 16S (ARNr16s) de S. suis. Existen trabajos publicados que plantean que los cebadores para GDH son menos específicos que los del ARNr16S, por ejemplo Streptococcus gallolyticus se identificó erróneamente como S. suis utilizando esta diana (Le HTT y col., 2013).

Aunque S. suis puede cultivarse apropiadamente en los medios utilizados en los laboratorios veterinarios, cuando produce meningitis en humanos, en los laboratorios de medicina humana, se ha identificado erróneamente como un enterococo (Streptococcus pneumoniae, Streptococcus bovis), con un Streptococcus viridans (Streptococcus anginosus y Streptococcus vestibularis) o incluso como Listeria monocytogenes, de ahí la importancia de las técnicas moleculares y su implementación en ambos laboratorios (Tien, 200).

En 1998, Townsend y col. publicaron la secuencia de una pareja de cebadores para P. multocida que ha sido utilizada hasta la fecha exitosamente para corroborar su identificación. La PCR es rápida, sensible y específica, pero debe estar apoyada por un riguroso sistema de buenas prácticas que evite las contaminaciones entre los locales donde se prepara la mezcla de reactivos y aquellos donde se añade el ADN y se revela el resultado, principal desventaja de esta metodología, que puede dar resultados falsos positivos.

S. suis produce una cápsula polisacarídica en su superficie, según su composición química se describieron 35 serotipos (Gottschalk y col., 1993). En la actualidad se reconocen 33 (1- 31, ½ y 33) (Liu y col., 2013), pues los serotipos 32 y 34 se reclasificaron como Streptococcus orisratti (Hill y col., 2013). Aunque aún no se esclarece la relación serotipo y una condición patológica dada, las cepas aisladas de animales enfermos pertenecen en orden decreciente a los serotipos 2, 3, 4, 5, 7, 8 y 1/2 en países de Asia (Kim y col., 2010), en Europa los serotipos 9, 1 y 14 (Wiselink y col., 2010) y en Canadá los serotipos 2, 3, 4, 7 y 8 (Messier y col., 2008). Existen dos laboratorios de reconocido prestigio en Dinamarca y Canadá que basan la tipificación de S. suis mediante la técnica de coaglutinación con el uso de antisueros obtenidos a partir de cepas de referencia (Gottschalk y col.,1993).

Se han valorado otras opciones para determinar los serotipos: la genoserotipificación, es decir, la detección en el genoma de la bacteria a través de la PCR, un fragmento de los locus que participan en la biogénesis de las enzimas para la síntesis de los polisacáridos capsulares, de hecho ya ha sido publicada la secuencia de cebadores que permiten la identificación de los 33 genoserotipos por PCR (Liu y col., 2013; Cai1 y col., 2014).

Las cepas de P. multocida también producen una cápsula que por su composición química ha permitido identificar 5 tipos capsulares (A, B, C, D y E) los cuales están relacionados con la especie animal que afectan, en el caso del cerdo las cepas tipo capsular A producen neumonías fundamentalmente y las del tipo capsular D la RAP. Al igual que S. suis, el tipo capsular de P. multocida se puede detectar por la utilización de antisueros y también mediante la genoserotipificación para lo cual es recomendado el trabajo publicado por Townsend y col. quienes dieron a conocer la secuencia de los cebadores específicos para definir por PCR de qué tipo capsular se trata.


Ensayos de laboratorio aplicados a la epidemiologia de S. suis y P. multocida

Se han utilizado diferentes métodos de laboratorios fenotípicos y moleculares para caracterizar la diversidad de cepas dentro de una especie, pero la falta de reproducibilidad entre los laboratorios ha sido el principal inconveniente (Järvinen y col., 1999). La metodología basada en múltiples locus de secuencias tipo MLST se ha implementado para la vigilancia epidemiológica de las infecciones producidas por diferentes géneros de bacterias que presenta una diversidad poblacional (Aanensen y col., 2005). Se trata de una herramienta de comunicación global, de gran reproducibilidad que se basa en la amplificación y secuenciación de un conjunto de fragmentos de genes con función metabólica a partir de varias cepas. Los productos de PCR son secuenciados y se depositan en bases de datos para permitir su comparación a nivel mundial y mediante programas computacionales se agrupan en varios complejos de secuencias tipos (ST) (Aanensen y col., 2005).

Fue publicado por primera vez un modelo de MLST para S. suis por King y col. en el 2002. Las cepas más virulentas que producen brotes en Europa y Asia pertenecen a los complejos ST1 and ST16 mientras en América del Norte las cepas menos virulentas pertenecen a los complejos ST25 y ST28 (Atanassov y col., 2015). Un esquema MLST fue desarrollado para P. multocida pero la mayoría de los aislados que han sido procesados son de origen aviar, muchas de las ST son específicas de los hospedadores en los que fueron encontrados. La ST13 fue una excepción pues en la misma agrupa asilados de origen bovino y porcino (Subaaharan y col., 2010).

Control de la infección por S. suis y P. multocida

Para el control de estas infecciones se utilizan varias alternativas: la aplicación de antibióticos, vacunas y estrategias de manejo combinadas con un adecuado sistema de bioseguridad. Se han investigado más las estrategias de vacunación para el control de la infección por S. suis, debido a que presenta una mayor heterogeneidad. Las opciones más utilizadas han sido las cepas inactivadas, los polisacáridos conjugados, cepas recombinantes, cepas vivas mutadas y vacunas de subunidad (Fittipaldi y col., 2007; Baums y col., 2010). Las estrategias de vacunación tienen el reto de insertarse en un entorno donde prevalecen la interferencia por anticuerpos pasivos y la presencia de otras infecciones concurrentes (Halbur y col., 2001).

Para tratar las infecciones por S. suis en animales y humanos los antibióticos que más se han usado son las aminopenicilinas y las quinolononas. La PCR también puede utilizarse para la detección con rapidez en el genoma de la bacteria de genes que están relacionados con la resistencia a determinados antibióticos. En los años más recientes varios grupos de trabajo han reportado el incremento en el número de cepas resistentes fundamentalmente a quinolonas (Escudero y col., 2007; Zhang y col., 2015). Un estudio realizado en nuestro laboratorio agrupó colecciones de cepas de P. multocida y S. suis de dos periodos diferentes y encontró un incremento notable en los porcentajes de resistencia a fármacos de uso en porcicultura y salud pública (figuras 1 y 2) ( Baez y col., 2012; Espinosa y col., 2012).

Una expresión asociada a la resistencia es la habilidad que presentan las bacterias para adherirse a superficies bióticas y abióticas y producir biopelículas garantizando su persistencia, incluso en el ambiente. La formación de biopelículas en superficies abióticas y en tejidos se ha demostrado para S. suis (Bonifait y col., 2008), y para P. multocida solamente en superficies abióticas (Ramachandranpillai y col., 2013). Los ensayos de adherencia en placas de S. suis han demostrado que las cepas no tipificables, que no expresan material capsular en su superficie, muestran un mayor hidrofobicidad que favorece la adherencia celular a estas superficies y esto podría favorecer su persistencia en explotaciones porcinas, por lo que aun cuando estas cepas no pertenecen a ningún serotipo conocido deben tenerse en consideración al elaborar estrategias de control (Willenborg y col., 2014).


Conclusiones

Las recomendaciones para el control de estas infecciones se basan en una selección cuidadosa y un apropiado uso de los antimicrobianos, para evitar la emergencia de cepas resistentes que puedan transferir marcadores genéticos entre las cepas. Estas recomendaciones se deben apoyar en un adecuado respaldo en el laboratorio dirigido a la detección de los microorganismos para una correcta interpretación de los resultados teniendo en consideración aspectos específicos de la unidad de crianza. Es preciso que los usuarios conozcan qué patógenos pueden estar presentes en sus granjas, teniendo en cuenta que cada unidad representa un sistema biológico diferente y no es apropiado extrapolar los resultados.

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