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La tecnología blu-ray aplicada al diagnóstico de patógenos

La tecnología blu-ray aplicada al diagnóstico de patógenos

Los sistemas sensores basados en la tecnología de disco compacto consisten en un conjunto de análisis de micromatrices que integra el reconocimiento molecular en la superficie de un disco compacto estándar. En este sentido, un disco compacto blu-ray tiene unas posibilidades excepcionales como soporte analítico interactivo. Además, es posible leer los resultados con un detector comercial.

Sergi Morais, Luis A. Tortajada-Genaro y Ángel Maquieira
Departamento de Química
Centro de Reconocimiento Molecular y Desarrollo Tecnológico (IDM)
Universitat Politècnica de València
Imágenes cedidas por los autores

El control de las enfermedades de animales de producción es uno de los objetivos prioritarios de la sanidad animal. Para ello, se siguen una serie de procedimientos veterinarios con la finalidad de lograr un mayor bienestar animal y seguridad alimentaria, controlando y evitando enfermedades que afecten a los alimentos y se transmitan a las personas. A fin de maximizar la productividad de las explotaciones, es necesaria la implantación de programas sanitarios eficaces que controlen, por ejemplo, la aparición de brotes epidémicos causados por agentes infecciosos. Estos programas sanitarios deben contemplar un seguimiento de las patologías presentes que permitan establecer pautas adecuadas; y es que la mayor parte de las infecciones afectan a la productividad, disminuyendo tasas reproductivas, rendimiento lechero e índices de transformación. Por ello, disponer de herramientas diagnósticas adecuadas permitirá la aplicación de programas sanitarios eficaces que optimicen la productividad, la sanidad y el bienestar animal.

La obtención de técnicas rápidas, sensibles y fiables que permitan obtener resultados de una forma rápida a un coste competitivo sigue siendo un objetivo prioritario para los laboratorios de ensayo y para las industrias que necesitan realizar un control de los animales y de los alimentos derivados. Cuando se trata de infecciones, se hace necesario cada vez más identificar los microorganismos infecciosos de una forma más específica y llegar a identificaciones de especie. Por ello, es preciso desarrollar tecnologías que permitan llegar a este grado de selectividad en el análisis microbiológico.

Los métodos microbiológicos clásicos son herramientas de diagnóstico lentas que requieren varios días, periodo que se puede ampliar en caso de que la muestra sea positiva y haya que realizar pruebas adicionales de confirmación. Por otra parte, la identificación de un serotipo concreto no es posible si no se recurren a métodos adicionales de caracterización. La necesidad de realizar un control de los animales o de los productos derivados de una forma rápida y eficaz requiere técnicas analíticas con una elevada sensibilidad y selectividad, así como una alta capacidad de trabajo a un coste bajo, dado el gran número de muestras a ensayar. Para ello, los métodos moleculares basados, por ejemplo, en la reacción en cadena de la polimerasa son una alternativa muy apropiada debido a su gran sensibilidad y selectividad. Sin embargo, presentan limitaciones como el bajo número de dianas que pueden detectar en una sola reacción sin comprometer la sensibilidad del método y el elevado coste de los sistemas detectores.

Métodos basados en microarrays

Los métodos basados en microarrays convencionales son una técnica que presenta la ventaja de poder detectar miles de sondas de ADN en una única reacción, lo que permite en un mismo ensayo detectar multitud de microorganismos con una elevada sensibilidad y selectividad. Un microarray consiste en una matriz bidimensional de moléculas (generalmente biorreceptores) ordenadas sobre un sustrato sólido, en posiciones conocidas. Normalmente las superficies empleadas son planas y uniformes de modo que permiten el anclaje, mediante impresión, de biomoléculas (ADN, anticuerpos, proteínas, carbohidratos, etc.), espacialmente dispuestas. Se trata de un sistema de análisis masivo que permite determinar en un solo experimento miles de diferentes sustancias en una misma muestra. La detección y cuantificación se lleva a cabo mediante fluorescencia o colorimetría, y en menor medida por espectrometría de masas, electroquímica, interferometría, etc.

Actualmente, el vidrio es el soporte convencional sobre el que se fabrican microarrays debido a su baja fluorescencia de fondo, transparencia, resistencia térmica y a la variedad de vías de inmovilización química que presenta. Sin embargo, se dispone de materiales poliméricos sintéticos que ofrecen propiedades mecánicas y químicas atractivas, son más baratos y su fabricación es más simple y flexible.

Materiales procedentes de la industria electrónica

Una variante prometedora es el uso de materiales procedentes de la industria electrónica como los discos compactos blu-ray, especialmente si se utiliza el lector/grabador de discos como detector. Así, para que un desarrollo analítico completo usando discos sea práctico es necesario introducir un sistema integrado de detección de la información contenida en los discos que, simultáneamente, podrá contar con una serie de ventajas en términos de efectividad, precio y portabilidad. Los sistemas sensores basados en la tecnología de disco compacto consisten en un sistema de análisis de micromatrices que integra el reconocimiento molecular en la superficie de un disco compacto estándar. En este sentido, un disco compacto blu-ray tiene unas posibilidades excepcionales como soporte analítico interactivo. Además, es posible leer los resultados con un detector comercial.

Prototipo lector de disco.

La tecnología del disco compacto

La estructura de un disco compacto consiste en un sustrato de policarbonato con surcos micrométricos metalizado con una película reflectante de aluminio (40-100 nanómetros de espesor). La naturaleza química del sustrato permite el anclaje directo o indirecto de receptores moleculares (sondas de ADN, proteínas, carbohidratos, etc.) con una alta densidad de inmovilización (100 analitos/mm2). Por otra parte, el lector de discos ópticos comerciales es un dispositivo electrónico de consumo muy sofisticado con una elevada resolución óptica (420 nm), lo que permite desarrollar ensayos de alta densidad. A su vez, el lector se fabrica a gran escala, lo que explica el bajo coste de estos equipos (oscila entre 100 y 300 euros).

El uso de estos nuevos sistemas sensores basados en la tecnología blu-ray aporta importantes ventajas en la realización de bioensayos: su capacidad de trabajo, miniaturización, portabilidad y sencillez de operación con un coste muy competitivo. Por otra parte, esta técnica permite incorporar multitud de sondas en el mismo soporte, proporcionando un gran volumen de información de gran relevancia para los estudios epidemiológicos y de caracterización, con una alta capacidad de trabajo, utilizando detectores baratos en adquisición y mantenimiento y que pueden ser utilizados fuera del laboratorio y por personal no experto. Especialmente, estas prestaciones son importantes cuando se pretende la caracterización microbiana, detección de patógenos y empleo in situ.

La tecnología de disco compacto se ha empleado satisfactoriamente para el desarrollo de ensayos multiplex en formato de micromatriz1 para la determinación de biomarcadores2, alérgenos alimentarios3 y, recientemente, para la detección simultánea de toxinas e identificación de patógenos como Salmonella spp. y Cronobacter spp. en muestras de leche4. Así pues, esta estrategia es muy adecuada para diseñar ensayos de alta densidad para el diagnóstico veterinario, dadas las ventajas que presentan este tipo de soportes.

Las ventajas del diagnóstico mediante blu-ray
  1. Gran superficie analítica (~90 cm2) en la que depositar miles de sondas de ADN.
  2. Fabricación a gran escala de productos de alta calidad a muy bajo precio.
  3. Posibilidad de integrar tanto información numérica como bioquímica, identificando cada punto de cada matriz y almacenando los resultados del ensayo en la misma plataforma física en la que se desarrolla el análisis.
  4. Uso del lector/grabador de discos compactos como detector químico, el cual, al igual que los discos compactos, se comercializa a bajo precio, destacando además su ubicuidad, robustez de funcionamiento, facilidad de uso, portabilidad, capacidad de trabajo y operar in situ.
Estas características hacen de la tecnología de disco compacto un sistema analítico muy interesante para el desarrollo de métodos de diagnóstico veterinario que permitan la identificación singular de microorganismos causantes de la enfermedad y conseguir de este modo un diagnóstico más rápido, preciso, barato y seguro, y por lo tanto una mayor productividad, sanidad y bienestar animal.

Bibliografía

1. Morais S. Tortajada-Genaro LA, Arnandis-Chover T, Puchades R, Maquieira A. Anal. Chem. 2009, 81, 5646-5654
2. Morais S. Tamarit-López J, Carrascosa J, Puchades R, Maquieira A. Anal. Bioanal. Chem. 2008, 391, 2837-2844
3. Tortajada-Genaro, LA, Santiago_Felipe S, Morais S, Gabaldón JA, Puchades R, Maquieira A. J. Agric. Food Chem. 2012, 60, 36-43
4. Arnandis-Chover T, Morais S, González-Martínez MA, Puchades R, Maquieira A. Biosens. Bioelectron. 2014, 51, 109–114

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