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Detección de Brachyspira y caracterización de las lesiones histopatológicas

Detección de Brachyspira y caracterización de las lesiones histopatológicas

El objetivo de este trabajo fue determinar si existe relación entre la observación de espiroquetas en un frotis de mucosa del colon de cerdos y la diarrea y la existencia de lesiones histopatológicas compatibles con bacterias del género Brachyspira.

Natalia Illanes, Judith Bertone, Silvia Romanini, Bibiana Pelliza y Pablo Tamiozzo
Departamento Patología Animal
Universidad Nacional de Río Cuarto (Argentina)
Imágenes cedidas por los autores

El género Brachyspira son espiroquetas que, además de a los cerdos, afectan a otras especies animales y al hombre (Hampson y Trott, 1995). En producción porcina, B. hyodysenteriae y B. pilosicoli son las que tienen mayor impacto en la salud.

B. hyodysenteriae causa disentería porcina (Hampson y Trott, 1995) y B. pilosicoli produce espiroquetosis intestinal porcina (Harris y cols., 2000). Las técnicas bactereológicas se utilizaron como herramienta en el diagnóstico presuntivo en diferentes enfermedades. Entre ellas, la tinción de Gram, realizada a partir de cultivos o directamente de lesiones, resulta una técnica de fácil acceso a laboratorios y se describe ampliamente en la bibliografía como apoyo al diagnóstico para distintos microorganismos (Uzal y cols., 1996).

Las técnicas de histopatología permiten identificar lesiones compatibles con la presencia de Brachyspira spp.: abscesos en la luz de las criptas, células inflamatorias mononucleares presentes en la lámina propia del órgano y presencia de espiroquetas en la luz del órgano y dentro de las glándulas mediante la coloración de Wartyn-Starry (W-S) (Hampson y Trott, 2000, Jensen y cols. 2004). La técnica de PCR se usa como diagnóstico de certeza frente a cuadros de diarrea en cerdos en crecimiento (Jensen, 1999; La y cols., 2003). Sin embargo, su coste hace que se dificulte el diagnóstico en laboratorios pequeños que no cuentan con el equipamiento adecuado.

El objetivo de este trabajo fue determinar si existe relación entre la observación de espiroquetas en un frotis de mucosa del colon de cerdos y la diarrea y la existencia de lesiones histopatológicas compatibles con bacterias del genero Brachyspira. Se propone desarrollar una metodología sencilla usando técnicas combinadas, que permitan realizar un diagnóstico presuntivo rápido frente a un caso de diarrea.

Materiales y método

Se seleccionaron 20 establecimientos porcinos ubicados en las zonas de mayor producción de Argentina, que contaban con etapas productivas de parto a finalización y tenían problemas de diarrea. En cada granja se trabajó con las salas de animales de 8, 15 y 21 semanas de vida. Se eligieron tres cerdos de cada corral con diarrea a los que se les práctico la eutanasia y se les realizó la necropsia.

De cada animal se tomaron trozos de colon y se colocaron en recipientes con formol al 10 %. Dichos tejidos se procesaron para histopatología y se colorearon con hematoxilina-eosina (H/E) para buscar lesiones compatibles (abscesos en las criptas y células mononucleares en la lámina propia). Además, mediante la tinción Wartyn-Starry (W-S) se observó si había presencia de bacterias en la luz intestinal o dentro de las glándulas intestinales (Achacha y cols., 1996).

Se realizaron también dos extendidos finos de la mucosa que se colorearon con la tinción de Gram y con el método de impregnación de plata de Fontana-Tribondeau (Fontana, 1920; Babudieri, 1961). Ante la presencia de espiroquetas en los extendidos se hizo un conteo promedio en 10 campos de microscopía. Se tomaron muestras de materia fecal a las que se les realizó la prueba de Duplex-PCR (D-PCR) para detectar la presencia de B. hyodysenteriae y B. pilosicoli de acuerdo al protocolo de La y cols. (2003).

Resultados

De las 59 muestras de tejidos procesadas y coloreadas con H/E, 24 evidenciaron la presencia de lesiones comunes y compatibles con las causadas por Brachyspira spp. Se encontraron estructuras compatibles con espiroquetas en 16 muestras de tejidos coloreados con W-S (figura 1) y se observó la presencia de abscesos en la luz de las criptas y de células inflamatorias mononucleares en la lámina propia del intestino grueso (figura 2). El resto, 35 muestras, mostraron una o ninguna lesión.

Figura 1. Estructuras compatibles con espiroquetas en tejidos teñidos con Wartyn-Starry.
Figura 2. Abscesos en la luz de las criptas y de células inflamatorias mononucleares en la lámina propia del intestino grueso.

En 52/59 extendidos de mucosa coloreados con tinción de Gram se observaron estructuras bacterianas espiroquetiformes, gramnegativas, de color rosa pálido. Se contaron las estructuras y se estableció la mediana que fue de 9 espiroquetas, ya que 29 muestras contenían 9 o menos y otras 29 muestras tenían más de 9 espiroquetas. Esto se asoció a la presencia de dos lesiones principales: abscesos en la luz de las criptas e infiltrado mononuclear en la lámina propia, en los cortes histológicos del colon coloreados con H/E (tabla).

El 62 % de los casos cuyos extendidos tenían más de 9 espiroquetas en 10 campos también presentaron ambas lesiones, mientras que el 38 % tenían una o ninguna lesión. De 30 animales que presentaron menos de 9 espiroquetas en 10 campos, el 80 % presentaron una o ninguna lesión y el 20 % tuvieron ambas lesiones presentes.

De 59 muestras de materia fecal procesadas por D-PCR, dos fueron identificadas como B. hyodysenteriae y seis como B. pilosicoli.

Discusión

Las enfermedades digestivas producen pérdidas importantes para el sector porcino por lo que el diagnóstico es muy importante en estas explotaciones (Carvajal y cols., 2000). Por esta razón, se necesitan métodos precisos y rápidos para detectar enfermedades como la disentería porcina y la espiroquetosis intestinal porcina (La y cols., 2003). La tinción de Gram se utiliza para el diagnóstico de distintos microorganismos; siempre respaldada por un diagnóstico de certeza (Uzal y cols., 1996). Estudios anteriores demostraron que la coloración de Gram mostró sensibilidad y especificidad relativa de más del 90 % con respecto a la coloración de Fontana-Tribondeau, en muestras de extendidos de materia fecal de animales con diarrea. Esto indica que la tinción de Gram podría ser utilizada en el diagnóstico presuntivo de Brachyspira spp. (Illanes, 2008).

Figura 3. Extendido obtenido de cultivo puro coloreado con tinción de Gram.

Lo antes mencionado concuerda con Olson y Fales (1983), quienes afirman que la aproximación a un diagnóstico presuntivo de disentería porcina por la observación de signos clínicos, lesiones y la presencia de espiroquetas en extendidos teñidos es relativamente simple.

En cuanto a los hallazgos histopatológicos; el 62 % de los animales con diarrea con la tinción de Gram mostraron más de 9 espiroquetas en 10 campos, presentaron abscesos en el interior de las criptas e infiltrado mononuclear en la lámina propia. Esa prevalencia estaría indicando que un animal con diarrea que en el extendido de mucosa de colon teñido con Gram presenta más de 9 espiroquetas en 10 campos, tiene el 62 % de posibilidad de presentar las dos lesiones más importantes causadas por Brachyspira spp.

Sólo el 20 % de los animales que tuvieron 9 o menos espiroquetas en los extendidos teñidos con Gram presentaron ambas lesiones.

Esto indicaría que existe una correlación entre la cantidad de bacterias espiroquetiformes presentes en las muestras de mucosa de colon de animales con diarrea y la presencia de lesiones histopatológicas características en el intestino grueso, lo que hace suponer la presencia del microorganismo como agente causal de la diarrea. Lo mencionado concuerda con diversos autores que describen hiperplasia de células caliciformes, alargamiento de las criptas de Lieberkühn (Kinyon y cols., 1977; Achacha y cols., 1996), epitelio descamado y detritos en la luz de las glándulas (Jensen y cols., 2004) como hallazgos presentes en infecciones causadas por Brachyspira spp. (Hampson y Trott, 2000; Jensen y cols., 2004).

Los cortes teñidos con W-S mostraron numerosas espiroquetas en el borde proximal de la superficie epitelial y en las criptas dilatadas (Achacha y cols., 1996).

El número de espiroquetas presentes y los resultados del D-PCR permitieron asociar aún más la cantidad de espiroquetas presentes en los extendidos y las lesiones compatibles en el intestino grueso. Se evidenció que el porcentaje de muestras que presentaron ambas lesiones aumentó a medida que lo hizo la cantidad de espiroquetas en los frotis de los animales que resultaron positivos a D-PCR. Esto indica claramente que existiría una excelente asociación entre la cantidad de espiroquetas presentes en los extendidos de animales sospechosos y las lesiones causadas por B. hyodysenteriae y B. pilosicoli mencionadas en estudios previos (Jensen y cols., 2004; Hampson y Trott, 2000). Esto se correlaciona con la presencia del microorganismo en el epitelio del intestino grueso y en el interior de las criptas, puesto en evidencia mediante la coloración de W-S, que va en aumento en los diferentes rangos.

Se podría establecer una metodología útil y simple a implementar frente a un caso de diarrea en cerdos de crecimiento-terminación que permita un diagnóstico presuntivo. Se podrían utilizar estas pruebas de forma secuencial, procesando en la siguiente etapa sólo aquellas muestras que dieron positivas a la anterior (Tarabla, 2000).

Figura 4. Extendido obtenido de cultivo puro coloreado con tinción de Fontana Tribundeao.

Bibliografía

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Hampson D., Tott D. 1995. Intestinal spirochetal infections of pigs: an overview with an Australian perspective. Aust. Pig. Sc. Asoc. 139-169.
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Kinyon J., Harris D, Glock D. 1977 Enteropathogenicity of various isolates of Treponema hyodysenterie. A Soc for Mic. 638-646.
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Tarabla, H. 2000. Epidemiología diagnostica. Centro de publicaciones. Secretaria de Extensión. Universidad Nacional del Litoral. Santa Fe. Argentina. Cap. 4,5,9.
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