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Infertilidad en yeguas: un estudio citológico y microbiológico para evaluar el lavaje e hisopado como métodos de extracción de muestras endometriales

Última actualización 16/05/2005@00:00:00 GMT+1
La infertilidad en las yeguas es gran problema de la producción equina. Debido a ello, el examen pre-servicio habitualmente incluye la toma de muestras endometriales. La bibliografía cita dos métodos principales: hisopados y lavajes uterinos, atribuyendo distintas ventajas y desventajas a cada uno. Los autores de este trabajo analizaron las muestras provenientes del examen pre-servicio de 36 yeguas, con el objeto de comparar la eficiencia de estos dos métodos en el diagnóstico de endometritis.

Autores: `

Elida Fumuso, Pedro Soto, Daniel Jaca y Guillermo Corbetta: Facultad de Ciencias Veterinarias U.N.C.P.B.A. Paraje Arroyo Seco S/N Tandil, Provincia de Buenos Aires, Argentina.

José R. O’Connor: Clínica Equina Laboratorio de Diagnóstico San Isidro, Provincia de Buenos Aires, Argentina.

Mónica Sparo: Hospital Ramón Santamarina Tandil, Provincia de Buenos Aires, Argentina.

Enrique Aracil y César Lissarrague: Anatomía Patológica Tandil, Provincia de Buenos Aires, Argentina.

FUENTE: Publicado en la Revista de la Asociación Argentina de Veterinaria Equina Nro. 13, Vol 4, 20: 24, Año 1996. 

Sumario

El hisopado y el lavaje endometrial son dos métodos que se utilizan habitualmente para el diagnóstico de problemas reproductivos en la yegua, cuya consecuencia inmediata es la infertilidad. El objetivo de este trabajo fue comparar la eficiencia de ambos métodos como herramientas de diagnóstico.

Para ello se utilizaron 36 yeguas durante el examen pre-servicio a las que se les tomó muestras por hisopado y por lavaje uterino para estudios citológicos y microbiológicos. El análisis estadístico de este ensayo nos permitió conocer que ambas técnicas tienen una confiabilidad inferior al 95 % (P<0,05) para detectar problemas reproductivos a través del diagnóstico microbiológico. En el caso del diagnóstico de inflamación por citología tanto el hisopado como el lavaje tuvieron una confiabilidad de 100 % (P>0,05). En base a esto establecemos que la cantidad de éxitos obtenidos mediante cultivo, ya sea lavaje o hisopado, difiere significativamente de los resultados obtenidos por citología.

Como conclusión, surge la necesidad de realizar los estudios microbiológicos acompañados de los citológicos para obtener diagnósticos confiables, más allá del método que se utilice para tomar las muestras.

Introducción

La infertilidad en yeguas es un problema que afecta la producción equina tanto a nivel nacional como internacional.

Este problema obedece a muchas causas, entre ellas infecciosas, anatómicas, inmunológicas, desbalances nutricionales, y psicológicas siendo éstos últimos los de menor importancia en producción equina y los más sencillos de resolver con una dieta adecuada y descanso.

Frente a la importancia del problema, se han llevado a cabo un gran número de trabajos sobre metodologías de diagnóstico con distintos enfoques.
El uso de los cultivos microbiológicos y pruebas de sensibilidad a los antimicrobianos fueron en un primer momento la única alternativa para el diagnóstico de endometritis, piómetras y abortos. En la actualidad, asociándolos a la citología exfoliativa se ha logrado obtener un método rápido, sencillo y económico, que al ser medianamente invasivo no presenta riesgos para el paciente y de mayor sensibilidad para detectar la inflamación que pueda interferir con la fertilidad.

Habitualmente el examen pre-servicio de las yeguas incluye la toma de muestras endometriales (Ricketts, S.; Blanchard, T.; Varner, D. & Schumacher, J.). Para realizar la extracción de las mismas, la bibliografía recomienda el uso de hisopos protegidos o lavajes endometriales, atribuyéndole ventajas y desventajas a cada uno de los métodos con respecto a su manejo (Ricketts, S.; Schmidt, A.) Entre ellas y de acuerdo a nuestra experiencia, podemos decir que el hisopado es un método rápido, sencillo, y la muestra obtenida no necesita manejos previos, como la centrifugación para su posterior procesamiento. Dentro de las desventajas tenemos el hecho que las muestras obtenidas provienen de la región más próxima al cuello uterino (Roszel, J.), su costo es elevado, contando que necesitamos uno para citología y otro para microbología, además de no permitir tomar muestras adecuadas para el estudio de gérmenes anaerobios (Sutter, V.).

Los lavajes permiten obtener muestras de un área superficial más amplia, el material utilizado es económico, y la misma muestra sirve para citología y microbiología; incluso en gérmenes anaerobios, si usamos soluciones reducidas previamente (Sutter, V.). Entre los inconvenientes que presentan citamos que, según la práctica que posea el operador, puede resultar un método engorroso y ocasionar lesiones si no se realiza cuidadosamente. La necesidad de la centrifugación para el posterior manejo de la muestra agrega un paso más a tener en cuenta en la rutina de laboratorio.

Si bien existen amplias recomendaciones sobre el manejo, escasas o nulas son las referencias comprobadas con respecto a la eficiencia de esos métodos. El objetivo de este trabajo fue evaluar la eficiencia del hisopado y el lavaje para detectar procesos inflamatorios asociados a infección que pudieran afectar la fertilidad, realizando citología exfoliativa endometrial y cultivo microbiológico de las muestras tomadas por estos métodos en yeguas que se presentan para el examen pre-servicio.

Materiales y métodos

Animales:
Se trabajó con 36 yeguas, cuyas edades variaron entre 4 y 17 años de edad; durante la temporada de servicio 24 recibieron servicio por inseminación artificial y 12 a campo. Las muestras fueron tomadas durante el examen genital previo al servicio. Los datos anamnésicos de las yeguas, así como los hallazgos durante la revisación clínica, fueron volcados a planillas para su posterior interpretación.

Recolección de las muestras:

Hisopados:
Fueron tomados con hisopos protegidos, de uso comercial, diseñados para equinos. Se utilizaron dos hisopos por animal.
a) Uno para citología exfoliativa, con el que directamente se hicieron tres improntas en portaobjetos. Posteriormente fueron fijadas con polietilenglicol, mientras estaban húmedas, para su correcta conservación.
b) Otro para cultivo microbiológico se inoculaba en medio de transporte Ammies.

Lavajes:
Fueron realizados con 50 ml. de Solución de Cloruro de Sodio al 0,9%. Para ello se usaron jeringas punta Tonney con un intermediario de látex unido a una pipeta de inseminación. Con el objeto de evitar la contaminación esta maniobra fue realizada con la mano doblemente enguantada llevando el operador la pipeta entre ambos guantes, una vez pasado el cérvix con el dedo se hizo presión con la pipeta perforando el guante e introduciendo la pipeta en el útero. Una vez infundido el líquido fue aplicada una presión negativa, que se mantuvo mientras la pipeta fue movida laterolateralmente y de adelante hacia atrás con el dedo índice, durante uno o dos minutos antes de ser extraída. La muestra aspirada, cuyo volumen fue variado, se introdujo parte en un tubo conteniendo 5 ml de etanol al 40% en solución salina y la otra parte en medio de transporte Ammies para cultivo microbiológico.

Procedimientos para Citología Exfoliativa
Las muestras obtenidas de hisopados se procesaron directamente.

Las provenientes de lavajes fueron centrifugadas a 1500 rpm durante 15 minutos, se descartaba el sobrenadante y con el sedimento se hicieron como mínimo dos extendidos, siendo fijados de la misma forma que las improntas de los hisopados. Con este método de fijación los preparados fueron conservados varios días sin alteraciones de morfología ni capacidad tintorial de las células.

En ambos casos se realizó la hidratación de los preparados para retirar el fijador con tres lavajes por inmersión de alcohol, el primero 2 minutos y los dos restantes 30 segundos.

Se hicieron dos coloraciones, la de Giemsa y un simplificación de la de Papanicolao llevada a cabo por los autores y que consta, una vez hidratada la muestra, de los siguientes pasos:

Hematoxilina activada: 4 minutos                                   
Lavado con agua                                      
Alcohol 96º: 30 segundos
Orange: 3 minutos
Alcohol 96º: 30 segundos

Alcohol 96º: 30 segundos
EA: 4 minutos
Alcohol 96º: 30 segundos
Alcohol 96º: 30 segundos
Alcohol 96º: 30 segundos
Alcohol 96º: 30 segundos

Dejar secar: Temperatura ambiente
Xilol: 2 minutos  

El montaje para las dos coloraciones se hizo con glicerina.
La observación microscópica de los preparados se hizo con 200 aumentos  y los detalles con 400.

Los datos obtenidos nos permitieron inferir si había o no inflamación. De acuerdo a la presencia de neutrófilos, estado de los mismos (cambios tóxicos o degenerativos), cambios en la disposición y aspecto de las células epiteliales desde ligero a marcadamente atípico y si esa inflamación era producto de acción microbiana de acuerdo a la detección de agentes microbianos y fagocitosis en los extendidos coloreados.

Procedimientos para microbiología:
El material recolectado de cada yegua, en el medio de transporte, fue sembrado por duplicado, hisopado y lavaje, de la siguiente forma: en aerofilia a 37 grados C, en agar Mac Conkey durante 48 hs. y en agar Sabouraud 96 hs. En microaerofilia a 37 grados C, en agar chocolate con y sin estreptomicina 96 hs. En microaerofilia las primeras 24 hs. y en aerofilia 24 lis. más en agar tripticasa soya sangre.

Las colonias bacterianas fueron identificadas bioquímicamente según las técnicas del manual Bergey*.

Análisis estadístico:
Considerando que la citología tiene 100% de éxito en la detección de procesos inflamatorios y que una herramienta de diagnóstico sería útil y confiable si tiene un 95 % de exactitud se realizó un test binomial para poner a prueba esta hipótesis con el cultivo por hisopado y el cultivo por lavaje, tomando como éxito y fracaso la concordancia o no con los resultados de la citología.

Por otra parte se llevó a cabo la comparación entre la cantidad de éxitos de los distintos métodos para tomar las muestras para cultivo (Hisopado vs. Lavaje) mediante el test de Cochran, dado que las observaciones pertenecen a un mismo animal  (bloques).

Resultados

La situación clínica en la que se encontraban las yeguas en el momento de la revisación previa al servicio la podemos ver en la Tabla 1.

En la Tabla 2 están descritos los resultados obtenidos en el laboratorio a partir de las muestras.

Como vemos, con ambos métodos se logró detectar la misma cantidad de yeguas con endometritis por diagnóstico citológico, cantidad que representó el 55,56% de las yeguas.

La correlación de ambos métodos para detectar la presencia de inflamación a través de la citología fue de 100%.

Los resultados obtenidos con los cultivos de las muestras tomadas mediante el hisopado o lavaje, en 36 yeguas se confrontaron con los obtenidos por citología y considerando que los resultados de la citología eran los correctos, se observó la cantidad de aciertos (1, éxitos) en el diagnóstico de procesos inflamatorios y qué cantidad de desaciertos (0, Fracasos). Para el caso de los cultivos realizados a partir del hisopado (CH), solamente 28 de ellos arrojaron los mismos resultados que la citología (28 éxitos y 8 Fracasos) y para los cultivos realizados a partir de lavaje (CL) 32 fueron aciertos (32 éxitos y 4 Fracasos). De acuerdo a esto y aplicando el test binomial en ambos casos se rechaza la hipótesis, es decir, las pruebas tienen un porcentaje de éxitos inferior al 95 % (P<0,05>).

Mediante la aplicación del test de Cochran se concluye que no hay diferencias estadísticamente significativas entre los métodos de toma y muestra (P>0,05).

Discusión

De acuerdo a los resultados de estas pruebas estadísticas, podemos decir que la forma de recolección de las muestras no modifica significativamente el porcentaje de éxitos en el diagnóstico, pero la cantidad de éxitos obtenidos mediante el cultivo, ya sea por lavaje o hisopado, difiere significativamente de los resultados obtenidos por citología.

En el caso de los hisopados de los 8 fracasos, 6 fueron por desarrollo de gérmenes sin presencia de inflamación detectable por citología, considerados como falsos positivos y 2 falsos negativos en los que a pesar de haber signos de inflamación de origen microbiano, estos gérmenes no desarrollaron. Para los lavajes, con la misma interpretación, tuvimos 3 falsos positivos y 1 falso negativo.

Conclusiones

En virtud de lo expresado anteriormente podemos concluir:

1)  La muestras obtenidas a partir de hisopados o lavajes para cultivo bacteriológico no reúnen las condiciones de confiabilidad mínimas necesarias para ser utilizadas como herramienta de diagnóstico, en forma aislada.

2)  Siendo la citología exfoliativa un procedimiento sencillo y económico, que incluso puede hacer el clínico durante el examen genital, es de vital importancia que este tipo de estudio sea incluido en el examen pre-servicio.

3)  La utilización de ambas técnicas, citología y cultivo brinda la confiabilidad necesaria al examen, nos permite tener la certeza de cuál es el o los agentes causales y hacer el tratamiento a través de los resultados obtenidos por los antibiogramas.

Bibliografía

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19.- Woolcok, J. B.: Equine bacterial endometritis diagnosis interpretation and treatment. Vet. Clin. NorthAm. (Large Anim. Pract.) 2 (2): 241-251, 1980


EJE CONCEPTUAL DEL ARTICULO
(Derechos reservados Portal Veterinaria.com)

Infertilidad en yeguas: un estudio citológico y microbiológico para evaluar el lavaje e hisopado como métodos de extracción de muestras endometriales

Objetivo del trabajo
Evaluar la eficiencia del hisopado y el lavaje endometrial para detectar procesos inflamatorios asociados a infección que pudieran afectar la fertilidad en yeguas que se presentan al examen pre-servicio.

Materiales y métodos
Animales:
- 36 yeguas
- Entre 4 y 17 años de edad
- Toma de muestras: durante examen genital previo al servicio.

Muestras
- Hisopados: 2 hisopos por animal, uno para citología y otro para bacteriología.
- Lavajes: con 50 ml de solución de Cloruro de Sodio al 0,9 %

Citología, datos obtenidos: presencia de inflamación (neutrófilos, su estado, disposición de las células epiteliales.

Microbiología: cultivo en aerofilia y en anaerobiosis, en medios para bacterias y en medios para hongos. Identificación bioquímica de las colonias.

Análisis estadísico
Se consideró a la citología como el método con un 100% de éxito en la detección de inflamación y que una herramienta de diagnóstico sería útil y confiable si tiene un 95 % de exactitud.
Para probar esta hipótesis: test binomial.

Comparación entre lavaje e hisopado: test de Cochran.

Resultados y discusión
- Se encontró un 83,33% de yeguas con problemas reproductivos
- Con ambos métodos se logró detectar la misma cantidad de yeguas con endometritis por diagnóstico citológico.
- Aplicando el test binomial, se rechaza la hipótesis, es decir, las pruebas tienen un porcentaje de éxitos inferior al 95 % (P<0,05>).

Conclusiones
- El hisopado o el lavaje, como métodos aislados, no son confiables como herramientas de diagnóstico.
- Ambas técnicas, citología y cultivo brindan la confiabilidad necesaria y la certeza de cuál es el o los agentes causales y hacer el tratamiento adecuado según los resultados del antibiograma.

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