L.Flori (1), C. Rogel Gaillard (1), V. Mariani(1,2), G. Lemonnier (1), M. Cochet (3), K. Hugot (1), P. Chardon (1), S. Robin (4) y F. Lefèvre (3)
(1) INRA-CEA, UMR 314, Laboratoire de Radiobiologie et d’Etude du Génome, Jouy en Josas, F-78350 Francia
(2) Centro Ricerche e Studi Agroalimentari, Parco Tecnologico Padano, Lodi, I-26900, Italia
(3) INRA, DSA, Unité de Virologie et Immunologie Moléculaires, Jouy en Josas, F-78352 Francia
(4) INA PG-ENGREF-INRA, UMR 518, Unité de Mathématiques et Informatique Appliquées, Paris F-75005 Francia, laurence.flori@jouy.inra.fr

El virus de la enfermedad de Aujeszky (PrV) es un patógeno bien conocido responsable de la enfermedad de Aujeszky, con un considerable impacto mundial en la especie porcina.
El PrV es un herpesvirus de la subfamilia Alphaherpesvirinae. Su genoma (unas 140 Kb) contiene 70 genes que codifican proteínas estructurales y no estructurales, cuya expresión está coordinada durante el ciclo lítico de la replicación viral (en el ciclo lítico la célula infectada muere por rotura al liberarse las nuevas copias virales). El virus PrV tiene un fuerte tropismo por las células epiteliales del tracto respiratorio oronasal, que son las primeras en interaccionar con las partículas víricas. Allí, el virus puede multiplicarse con gran facilidad y puede ser responsable en algunas ocasiones de síntomas respiratorios clínicos.
El conocimiento de la regulación de la expresión génica (activación o inactivación) que tiene lugar durante esta infección, tanto en los genes virales como en los celulares, es esencial para un mejor conocimiento de la fisiopatología de la infección y para la identificación de moléculas que participan en los mecanismos de resistencia/susceptibilidad. En los últimos años, los perfiles de expresión génica en las células hospedadoras o en las patógenas han sido ampliamente estudiadas y los microarrays de ADN han resultado ser unas herramientas muy eficaces para este tipo de investigaciones, pero no se había realizado un análisis de transcripción (paso de ADN a ARN) de PrV mediante microarrays. En este estudio se sigue simultáneamente la transcripción del virus PrV y de la línea celular epitelial porcina PK15 durante el curso de la infección mediante un experimento de microarray. Se persigue así determinar cuáles son las vías metabólicas que se modulan durante la infección por PrV en las células epiteliales, en relación con la expresión génica en el virus PrV. También se estudian los efectos específicos de la infección localizados en el complejo mayor de histocompatibilidad porcino (HCM) o en la región del antígeno leucocitario porcino (SLA). Esta región, que está localizada en el cromosoma submetacéntrico 7, es la primera que ha sido secuenciada completamente en porcino. Contiene algunos genes que codifican molélulas implicadas en las vías de presentación del antígeno SLA y otros genes que codifican proteínas del sistema inmunitario. Las moléculas clase I del SLA, que se expresan en casi todas las células nucleadas, presentan péptidos ajenos, que incluyen péptidos derivados de antígenos virales. Estas células están continuamente bajo la vigilancia de los linfocitos T citotóxicos (CTLs), que tienen un papel crítico en la defensa contra las infecciones víricas. Los herpesvirus han desarrollado estrategias para interferir en la vía antigénica del CMH clase I. La infección con PrV disminuye la expresión de las moléculas clase I del CMH en la superficie celular mediante la inhibición de la actividad del transporte de péptidos (TAP).



Las células porcinas PK15 se infectaron con partículas víricas purificadas de la cepa NIA3 tipo salvaje del virus de la enfermedad de Aujeszky con una multiplicidad de infección de 20 unidades formadoras de placa (pfu) por ml o incubación en un medio de cultivo libre de virus. Para el análisis transcripcional, se utilizó el mismo conjunto de células para llevar a cabo cuatro experimentos de replicación en las células infectadas verdaderamente (IV) y en las que se realizó una infección ficticia (con resuspensión viral sin los virus completos) (IF). Las células se recogieron para la extracción de ARN justo después de la infección (IV) o de las de la IF y a la(s) 1, 2, 4, 8 y 12 horas después de IV o IF. Se procedió entonces a la extracción y purificación del ARN total.
A continuación se realizó una q-RT-PCR (reacción de la cadena de la polimerasa cuantitativa a tiempo real). Se utilizó el ARN correspondiente a las muestras por triplicado de las células IF en T0 y las IV en T0, T2, T4, T8 y T12.
Se utilizaron dos microarrays en este experimento. Para seguir las modificaciones transcripcionales específicas que se dan simultáneamente en el virus y en las células, primero construimos un microarray ADN/ADNc (SLA/PrV microarray), en el CRB-GADIE (Centre de Ressources Biologiques-Génomique des Animaux Domestiques et d’Intérêt Economique, LREG, INRA, Jouy-en Josas, Francia) que tiene como objetivo los genes de la región SLA, los genes suplementarios que codifican otras moléculas inmunológicas importantes y todos los genes víricos. Este microarray se compone de 1.789 sondas de cuatro tipos:
• 420 sondas que mapearon un segmento del cromosoma 7 que incluye la región SLA y que representaron 272 secuencias únicas.
• 73 sondas específicas de genes que codifican moléculas que intervienen en la inmunidad pero que están fuera de la región SLA.
• 80 sondas específicas de PrV del total de los 70 genes víricos.
• 1170 sondas elegidas al azar para la normalización de la respuesta génica, procedentes de la biblioteca porcina cADN AGENAE.
• Las 46 sondas restantes corresponden a pruebas de control.
El segundo microarray es el comercial (Qiagen-NRSP8) que contiene 13.297 oligonucleótidos específicos de 8.541 genes porcinos y se utiliza para explorar más ampliamente las vías fisiológicas.
Para las hibridaciones del SLA/PrV se utilizaron muestras de todos los tiempos (T0, T1, T2, T4, T8 y T12 h posinfección -PI-) y cuatro para el comercial (T1, T2, T4 y T8 h PI). Posteriormente las señales luminosas de los pocillos se leen y se obtienen los datos, que son normalizados adecuadamente para realizar el análisis estadístico apropiado. Se seleccionaron como genes que se expresan diferencialmente aquellos con un FFD (fracción de falsas diferencias) de 0,05. Mediante el uso del software TmeV se identificaron grupos de genes con una cinética de expresión similar mediante el método (análisis clúster jerárquico con k-medias). Para información más detallada sobre materiales y métodos contactar con los autores.

Qué es un microarray

Un microarray o biochip es un sistema miniaturizado en el que se disponen, de forma ordenada y conocida, miles de fragmentos (sondas) de material conocido (ADN, ARN o proteínas) sobre un soporte sólido compuesto de pocillos. Para ello se sintetiza el material genético y se insertan de forma automática en una capa de cristal, silicio o plástico, colocándose en unas casillas (en realidad la palabra microarray hace referencia al soporte físico). Foto: Laurence Flori En cada pocillo se inserta una sonda, de tal forma que permite la hibridación de la cadena complementaria, si ésta existe en las muestras que se procesan. Posteriormente, se lava, de tal forma que de la muestra problema total sólo quedan ligados a los pocillos las cadenas complementarias a las sondas y se procede al revelado mediante un escáner óptico o con microscopía láser confocal. Después se analiza la imagen obtenida para conseguir un patrón de intensidades en cada casilla, que se procesa mediante la informática. El desarrollo de estos enfoques necesita gestionar y almacenar grandes cantidades de información, por tanto no es de extrañar que la llegada de estos dispositivos haya coincidido con la madurez de la bioinformática. Mediante los microarrays es posible estudiar no la existencia de uno u otro alelo de un gen determinado, sino el nivel de expresión de un gen. Por lo tanto, es una interesantísima herramienta para estudiar los mecanismos, como en el caso de la infección vírica, que conllevan activaciones y desactivaciones de la expresión génica.

La expresión de genes virales se detectó entre 2 y 12 h PI y aumentó en el tiempo. Parece que la mayoría de los genes se expresaron de 8 a 12 h PI. El número de genes virales diferencialmente expresados en las células IV e IF se incrementa drásticamente entre las 2 y las 8 horas y alcanza una meseta después de las 8 h (tabla). No hubo diferencias en la expresión de 19 genes virales entre las células infectadas y las de la infección simulada. Los primeros genes en los que se encuentran diferencias a 1 h PI fueron US1 y UL29, que codifican proteínas no estructurales (RSP40 y ICP8) y el gen UL49.5, que codifica la glicoproteína de la envoltura gN. La expresión diferencial del gen UL41 se detecta a las 8 h PI. Este gen codifica la proteína vhs (virion host shutoff) que es una proteína que contribuye a controlar la maquinaria de síntesis de la célula huésped y que se requiere para la inhibición de genes celulares.
Usando ambos microrarrays observamos que el número de genes celulares expresados diferencialmente aumentó especialmente entre 4 y 12h PI (tabla). No se observó inhibición global de la síntesis de proteínas en las células. Se encontraron una gran cantidad de genes que estaban parcialmente inhibidos desde las 4h PI y su número fue aumentando hasta las 12 h PI.
Encontramos que muchos procesos biológicos y funciones celulares están moduladas durante la infección por el virus PrV. En particular, la infección por PrV modifica la expresión de los genes involucrados en los mecanismos de presentación antigénica en la clase I del CMH. En realidad, algunos genes involucrados en estas vías metabólicas (SLA-Ia, TAP1, TAP2, CANX y PSMB8) disminuyeron en su expresión. Muchos genes relacionados con la inmunidad mediada por interferón (IRF1, IRF2, IRF5, IRF3, IFNAR2, IFI6, IFNA6, IFI30 y ISGF3G) se modularon durante la infección por PrV. Los genes involucrados en los mecanismos de apoptosis (algunos genes pertenecientes a la familia BCl2, FAIM2, algunas caspasas y HSP), en el metabolismo de los ácidos nucleicos (algunas histonas e histonas deacetilasas) y del citoesqueleto (ACTG1, ACTC1, ACTRT2, ACTA4, ACTL6, MYO1D y MYOA) también se modularon durante la infección por PrV.
Confirmamos mediante qRT-PCR que los genes de la clase I del SLA se regularon a la baja desde las 8 h PI, mientras que TAP1 y TAP2 lo estuvieron desde 8 y 4 h PI. Se detectó una regulación a la baja de forma temprana en los genes PSMB8 y PSMB9, antes de las 2 h PI.


Éste es el primer estudio en la expresión de la transcripción durante el curso de la infección. Nuestro trabajo demostró que los virus y las células hospedadoras pueden analizarse con un único microarray que combina conjuntos de sondas virales y del hospedador y confirmó la viabilidad de este tipo de enfoque, que es altamente relevante en el establecimiento de una relación directa entre la expresión génica del patógeno y de las líneas celulares. Además, el Qiagen–NRSP8 nos permitió explorar la transcripción porcina más ampliamente.
Obtuvimos una representación de la transcripciópn global del virus PrV durante el ciclo lítico con un 90% de las células infectadas. El incremento tanto en los niveles de transcripción como en el número de genes diferencialmente expresados en las células detectados desde las 4h PI estuvieron correlacionados con el crecimiento viral y coincidieron con el inicio de la liberación de la progenie extracelular. Nuestros resultados sugirieron que la maquinaria transcripcional está totalmente activa a las 8 h PI lo que permite la producción de una progenie viral masiva.
Puede observarse igualmente la transcripción cronológica transitoria clásicamente descrita. Sin embargo, se detectó una diferencia en la expresión del gen inmediatamente temprano (IE180) (que codifica un transactivador de la expresión génica temprana) sólo a las 4 h PI cuando el nivel de transcripción alcanza su pico, sugiriendo que el bajo nivel del transcrito IE180 es suficiente para inducir la transcripción de otros genes.
Incluso si no se observa una inhibición global de la síntesis de proteínas celular , nuestros resultados revelaron que la actividad celular de la proteína vhs, usualmente descrita como responsable para este proceso de inhibición, parece atribuirse a la nueva proteína sintetizada y no a la proteina vhs presente en el tegumento de la partícula vírica en el momento de producirse la infección.
PrV desarrolla estrategias para evitar las maniobras de respuesta del hospedador probablemente teniendo como objetivo algunas vías biológicas incluyendo la vía de presentación clase I del CMH. Muchos de los genes que pertencen a esta vía (CMH clase Ia, TAP1, TAP2, PSMB8) estuvieron regulados a la baja en nuestro experimento, lo que sugirió que el PrV desarrolló dos estrategias complementarias para evadir esta vía: en primer lugar el cierre de la bomba peptídica con la inhibición de la actividad de la TAP y en segundo, la alteración de la transcripción de los jugadores clave. Es muy interesante el hecho de que el gen viral UL49.5, que codifica una pro-teína inhibidora de la TAP, evidenció diferencias en su expresión de forma extremadamente temprana, a las 2 h PI, lo que indica que la evasión viral a través de la inhibición de la TAP puede comenzar antes de la expresión global (transcripción) del PrV. Además, otros genes que participan en la respuesta antiviral estaban regulados durante la infección, como los genes que pertenecen a la vía de señales de la IFN.
Nuestro análisis de transcripción confirmó que muchos otros procesos biológicos y funciones estuvieron modulados durante la infección en las células PK15, tal y como se ha observado previamente en otros estudios.
Los genes de las vías apoptóticas también se modularon durante la infección por PrV. La infección viral tiende a generar señales pre-apoptóticas para limitar la replicación viral, pero los virus y en particular los herpesvirus producen moléculas que actúan como inhibidores de la apoptosis. US3, que tiene un papel anti-apoptótico, aumenta su expresión desde las 8 h PI sugiriendo una posible actuación tardía anti-apoptótica. Los genes del metabolismo de los ácidos nucleicos se expresaron de forma diferenciada desde fases muy tempranas, con una represión de muchos de los que codifican para histonas y para componentes de los nucleosomas y se encontró una modulación de las histonas deacetilasas. El gen US3 podría inhibir la acetilación de las histonas durante la infección. El virus PrV parece estar igualmente inmerso en la regulación de la expresión de los genes que pertenecen a las señales del citoesqueleto. Es posible también que el US3 induzca modificaciones en el citoesqueleto celular, con un incremento en la diseminación del PrV.

Conclusiones

Nuestros resultados mostraron que la expresión génica del virus PrV y las células porcinas pueden analizarse conjuntamente con los microarrays, que proporcionan una cronología de la transcripción de los genes del PrV nunca descrita antes y que existe una relación temporal directa entre la expresión génica viral y del hospedador. El PrV pertenece a la misma subfamilia que el virus patógeno humano HSV-1. Es por ello un modelo pertinente para el estudio in vitro de la biología de esta subfamilia de virus y de sus interacciones con las células hospedadoras, por lo que además de las implicaciones ganaderas, este estudio contribuye a la sanidad pública. Los próximos pasos serán analizar el mecanismo de infección en otro tipo de células como las células dendríticas inmaduras así como estudiar la acción concreta de algunas proteínas, como la US3 mediante el uso de virus mutantes. Hay que tener en cuenta sin embargo que éste es un trabajo a largo plazo, ya que, por ejemplo, los experimentos presentados en este artículo han durado 18 meses.

Agradecimientos
Los autores quieren agradecer a Dr. René L’Haridon, Dr. Isabelle Oswald (LPT, INRA, Toulouse, France), Dr. Xiao Xiang Hu (State Key Laboratory for Agrobiotechnology, China Agricultural University, Beijing, China), Dr. Christine Renard (LREG, INRA, Jouy en Josas, France), Céline Urien, Jerome Lecardonnel y Céline Ducroix-Crepy (LREG, INRA, Jouy en Josas, France), Dr. Sophie Pollet, Dr. Claudia Bevilacqua y Emmanuelle Zalachas (PICT Plateform, INRA, Jouy en Josas, France), Dr. Sylvie Chevillard (LTE, CEA, Fontenay aux Roses), Philippe Bardou (SIGENAE, Toulouse, France). Este trabajo ha sido financiado por la fundación Genanimal (PRA 2004-B01, Agence Nationale de la Recherche, 2004-2007).


Bibliografía en poder de los autores